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현장 기능을 갖춘 랩온어칩(Lab-on-a-Chip) 시스템은 신속하고 정확한 진단 가능성을 제공하며 생물의학 장비와 숙련된 전문가를 이용할 수 없는 자원이 제한된 환경에서 유용합니다.그러나 다기능 분주, 주문형 출시, 안정적인 성능 및 시약의 장기 보관에 필요한 모든 기능을 동시에 갖춘 현장 검사 시스템을 만드는 것은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다.여기에서는 어떤 방향으로든 유체를 조작하고, 적용된 공기압에 정확하고 비례적인 반응을 제공하며, 갑작스러운 움직임과 진동에 대해 안정성을 유지할 수 있는 레버 작동식 마이크로 트래블 스위치 기술에 대해 설명합니다.또한 이 기술을 바탕으로 시약 도입, 혼합 및 반응 기능을 하나의 프로세스로 통합하여 18명의 환자의 모든 임상 비강 샘플에 대해 "샘플-인-앤서-아웃" 성능을 달성하는 폴리머라제 연쇄 반응 시스템의 개발에 대해서도 설명합니다. 인플루엔자 및 18개의 개별 대조군은 표준 중합효소 연쇄 반응과 형광 강도가 잘 일치합니다(Pearson 계수 > 0.9).또한 이 기술을 바탕으로 시약 도입, 혼합 및 반응 기능을 하나의 프로세스로 통합하여 18명의 환자의 모든 임상 비강 샘플에 대해 "샘플 인 앤서 아웃" 성능을 달성하는 중합효소 연쇄 반응 시스템의 개발도 설명합니다. 인플루엔자 및 18개의 개별 대조군을 사용하여 표준 중합효소 연쇄 반응과 형광 강도가 잘 일치합니다(Pearson 계수 > 0.9).Основываясь на этой technологии, мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции, которая объединяет фу нкции введения реагентов, смешивания и реакции в одном процессе, что обеспечивает выполнение «образец-в-ответ-выход» для всех клинических образцов из носа от 18 пациентов с Грипп и 18 отдельных контролей, в хорошем соответствии интенсивности флуоресценции со стандартной полимеразной цепной реакцией (к оэффициенты Pирсона> 0,9).또한 이 기술을 기반으로 주입, 혼합 및 반응 기능을 단일 프로세스로 결합하여 18명의 인플루엔자 환자의 모든 임상 비강 표본에 대해 샘플-인-반응-아웃을 가능하게 하는 중합효소 연쇄 반응 시스템의 개발에 대해서도 설명합니다.표준 중합효소 연쇄 반응 형광 강도(Pearson 계수 > 0.9)와 잘 일치하는 18개의 개별 컨트롤.또한 이 기술을 기반으로 시약 주입, 혼합 및 반응 기능을 통합하여 18명의 샘플 내 비강 환자 표본에서 모든 임상 비강 표본을 분석하는 중합효소 연쇄 반응 시스템의 개발에 대해서도 설명합니다. 인플루엔자와 18개의 개별 대조군, 형광 강도 일치 표준 중합효소 연쇄 반응(Pearson 계수 > 0.9)과 잘 맞습니다.제안된 플랫폼은 생체 의학 분석의 안정적인 자동화를 보장하므로 다양한 현장 검사 장치의 상용화를 가속화할 수 있습니다.
수백만 명의 목숨을 앗아간 2020년 코로나19 팬데믹과 같은 새로운 인간 질병은 세계 보건과 인류 문명에 심각한 위협을 가하고 있습니다1.바이러스 확산을 통제하고 치료 결과를 개선하려면 질병을 조기에 신속하고 정확하게 탐지하는 것이 중요합니다.테스트 샘플을 병원이나 진단 클리닉으로 보내고 전문가가 운영하는 중앙 집중식 실험실을 기반으로 하는 핵심 진단 생태계는 현재 전 세계적으로 약 58억 명의 사람들, 특히 자원이 제한된 환경에 살고 있는 사람들의 접근을 제한하고 있습니다.값비싼 생의학 장비와 자격을 갖춘 전문가가 부족한 곳입니다.2. 따라서 임상의에게 적시에 진단 정보를 제공하여 정보에 입각한 진단 결정을 내릴 수 있는 현장 검사(POCT) 기능을 갖춘 저렴하고 사용자 친화적인 랩온어칩 시스템을 개발하는 것이 시급합니다. .그리고 치료 3.
세계보건기구(WHO) 지침에 따르면 이상적인 POCT는 저렴하고, 사용자 친화적(최소한의 교육으로 사용하기 쉬움), 정확(위음성 또는 위양성 방지), 빠르고 안정적(우수한 반복성 특성 제공)이어야 하며, 제공 가능(장기 보관이 가능하고 최종 사용자가 쉽게 사용할 수 있음)4.이러한 요구 사항을 충족하려면 POCT 시스템은 수동 개입을 줄이기 위한 다양한 투여, 정확한 테스트 결과를 위한 시약 이동 규모 조정을 위한 주문형 출시, 환경 진동을 견딜 수 있는 안정적인 성능 등의 기능을 제공해야 합니다.현재 가장 널리 사용되는 POCT 장치는 모세관력에 의해 사전 고정화된 시약과 반응하여 매우 적은 양의 샘플을 앞으로 밀어내는 여러 층의 다공성 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 구성된 측면 흐름 스트립5,6입니다.저렴한 비용, 사용 용이성 및 빠른 결과라는 장점이 있지만 플로우 스트립 기반 POCT 장치는 다단계 분석 없이 생물학적 테스트(예: 포도당 테스트7,8 및 임신 테스트9,10)에만 사용할 수 있습니다.반응(예: 여러 시약 로딩, 혼합, 다중화).또한 유체 이동(즉, 모세관력)을 제어하는 추진력은 특히 배치 간에 좋은 일관성을 제공하지 않아 재현성이 떨어지고 측면 흐름 밴드가 주로 우수한 감지에 유용하게 됩니다.
마이크로 및 나노 규모의 확장된 제조 기능은 정량적 측정을 위한 미세유체 POCT 장치 개발의 기회를 창출했습니다.인터페이스(18, 19)의 특성과 채널(20, 21, 22)의 기하학적 구조를 조정함으로써 이러한 장치의 모세관력과 유속을 제어할 수 있습니다.그러나 특히 많이 젖은 액체에 대한 신뢰성은 제조 부정확성, 재료 결함 및 환경 진동에 대한 민감성으로 인해 허용되지 않습니다.또한 액체-기체 경계면에서 모세관 흐름이 생성되므로 특히 미세유체 채널을 액체로 채운 후에는 추가 흐름이 도입될 수 없습니다.따라서 보다 복잡한 검출을 위해서는 여러 단계의 샘플 주입을 수행해야 합니다24,25.
미세유체 장치 중에서 원심 미세유체 장치는 현재 POCT26,27에 가장 적합한 솔루션 중 하나입니다.구동 메커니즘은 회전 속도를 조절하여 구동력을 제어할 수 있다는 장점이 있습니다.그러나 원심력이 항상 장치의 바깥쪽 가장자리를 향하므로 더 복잡한 분석에 필요한 다단계 반응을 구현하기 어렵다는 단점이 있습니다.다기능 투여를 위해 원심력 외에 추가 구동력(예: 모세관 28, 29 및 기타 여러 30, 31, 32, 33, 34, 35)이 도입되지만 이러한 추가 힘은 일반적으로 차수이므로 예상치 못한 액체 이동이 여전히 발생할 수 있습니다. 원심력보다 크기가 작아서 작은 작동 범위에서만 효과적이거나 액체 방출이 필요한 경우에는 사용할 수 없습니다.원심 운동 방법 36, 37, 38, 열공압 방법 39 및 능동 공압 방법 40과 같은 원심 미세 유체에 공압 조작을 통합하는 것이 매력적인 대안임이 입증되었습니다.역퓨고역학 접근법을 사용하면 외부 및 내부 작용을 위해 추가 공동 및 연결 마이크로채널이 장치에 통합되지만 펌핑 효율(75%~90% 범위)은 펌핑 주기 수와 점도에 따라 크게 달라집니다. 액체의.열공압 방식에서 라텍스 멤브레인과 유체 전달 챔버는 갇힌 공기량이 가열되거나 냉각될 때 입구를 밀봉하거나 다시 열도록 특별히 설계되었습니다.그러나 가열/냉각 설정은 느린 반응 문제를 야기하고 감열성 분석(예: 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭)에서의 사용을 제한합니다.능동형 공압 접근 방식을 사용하면 양압을 동시에 적용하고 고속 모터에 의해 정밀하게 일치하는 회전 속도를 통해 요청 시 해제 및 내부 이동이 달성됩니다.공압식 액츄에이터(양압 41, 42 또는 음압 43)와 상시 폐쇄형 밸브 설계만을 사용하는 다른 성공적인 접근 방식도 있습니다.공압실에 순차적으로 압력을 가함으로써 액체가 연동식으로 앞으로 펌핑되고 상시 닫힘 밸브는 연동운동으로 인한 액체의 역류를 방지하여 복잡한 액체 작동을 실현합니다.그러나 현재 단일 POCT 장치에서 다기능 분배, 주문형 방출, 안정적인 성능, 장기 보관, 고점도 액체 취급 등 복잡한 액체 작업을 수행할 수 있는 미세 유체 기술은 제한되어 있습니다. 비용 효과적인 제조.모두 동시에.다단계 기능 작동이 부족한 것도 현재까지 Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat 및 Rhonda와 같은 소수의 상업용 POCT 제품만 성공적으로 공개 시장에 출시된 이유 중 하나일 수 있습니다.
본 논문에서는 그린링 마이크로 스위치 기술(FAST)을 기반으로 한 공압식 미세유체 액츄에이터를 제안한다.FAST는 마이크로리터에서 밀리리터까지 광범위한 시약에 필요한 모든 특성을 동시에 결합합니다.FAST는 탄성 멤브레인, 레버 및 블록으로 구성됩니다.공기압을 가하지 않고도 멤브레인, 레버, 블록을 단단히 닫을 수 있으며 내부의 액체를 장기간 보관할 수 있습니다.적절한 압력을 가하여 레버 길이에 맞게 조정하면 다이어프램이 팽창하여 레버를 열림 위치로 밀어 유체가 통과할 수 있게 합니다.이를 통해 다단계, 동시, 순차적 또는 선택적인 방식으로 액체의 다기능 정량 주입이 가능합니다.
우리는 인플루엔자 A 및 B 바이러스(IAV 및 IBV) 검출을 위한 샘플 내 반응 결과를 생성하기 위해 FAST를 사용하여 PCR 시스템을 개발했습니다.우리는 102개/mL의 검출 하한(LOD)을 달성했으며, 멀티플렉스 분석은 IAV 및 IBV에 대한 특이성을 보여주었으며 인플루엔자 바이러스 병원형 분석을 허용했습니다.18명의 환자와 18명의 건강한 개인의 비강 면봉 샘플을 사용한 임상 테스트 결과는 표준 RT-PCR과 형광 강도에서 좋은 일치를 보여줍니다(Pearson 계수 > 0.9).18명의 환자와 18명의 건강한 개인의 비강 면봉 샘플을 사용한 임상 테스트 결과는 표준 RT-PCR과 형광 강도에서 좋은 일치를 보여줍니다(Pearson 계수 > 0.9).Результаты клинических испытаний с использованием образца мазка из носа от 18 пациентов и 18 здоровых лиц показываят хорош еее соответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Piрсона > 0,9).18명의 환자와 18명의 건강한 개인의 비강 면봉 샘플을 사용한 임상 시험 결과는 표준 RT-PCR의 형광 강도(피어슨 계수 > 0.9) 간에 좋은 일치를 보여줍니다.0.9)。、。。。。。。。。。。 Результаты клинических испытаний с использованием образцов назальных мазков от 18 пациеntов 및 18 здоровых лиц показали хор ошее соответствие между интенсивностьу флуоресценции и стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Piрсона > 0,9).18명의 환자와 18명의 건강한 개인의 비강 면봉 검체를 사용한 임상 시험 결과 형광 강도와 표준 RT-PCR(Pearson 계수 > 0.9) 사이에 좋은 일치가 나타났습니다.FAST-POCT 장치의 예상 재료 비용은 약 US$1(보충 표 1)이며 대규모 제조 방법(예: 사출 성형)을 사용하여 더욱 줄일 수 있습니다.실제로 FAST 기반 POCT 장치는 WHO에서 요구하는 모든 필수 기능을 갖추고 있으며 POCT 시스템의 중추인 플라즈마 열 사이클링44, 무증폭 면역분석45 및 나노바디 기능화 테스트46와 같은 새로운 생화학적 테스트 방법과 호환됩니다.가능성.
그림에.그림 1a는 FAST-POCT 플랫폼의 구조를 보여주며, 사전 저장 챔버, 혼합 챔버, 반응 챔버, 폐기물 챔버 등 4개의 액체 챔버로 구성됩니다.유체 흐름 제어의 핵심은 사전 저장 챔버와 혼합 챔버에 위치한 FAST 설계(탄성 멤브레인, 레버 및 블록으로 구성)입니다.공압 작동 방식인 FAST 설계는 폐쇄/개방 전환, 다양한 투여, 주문형 유체 방출, 안정적인 작동(예: 환경 진동에 둔감함) 및 장기 보관을 포함한 정밀한 유체 흐름 제어를 제공합니다.FAST-POCT 플랫폼은 그림 1b의 확대도에 표시된 것처럼 백킹 층, 탄성 필름 층, 플라스틱 필름 층 및 커버 층의 4개 층으로 구성됩니다(보조 그림 S1 및 S2에도 자세히 표시됨). ).모든 채널과 유체 운송 챔버(예: 사전 저장 및 반응 챔버)는 0.2mm(가장 얇은 부분)에서 5mm 두께 범위의 PLA(폴리락트산) 기판에 내장되어 있습니다.탄성 필름 소재는 300μm 두께의 PDMS로, '얇은 두께'와 낮은 탄성 계수(약 2.25 MPa47)로 인해 공기 압력을 가할 때 쉽게 팽창합니다.폴리에틸렌 필름층은 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET)를 두께 100μm로 만들어 공기압에 의한 과도한 변형으로부터 탄성 필름을 보호한다.챔버에 해당하는 기판층에는 액체의 흐름을 제어하기 위해 힌지로 커버층(PLA로 제작)에 연결된 레버가 있습니다.양면 접착 테이프(ARseal 90880)를 사용하여 탄성 필름을 지지층에 접착하고 플라스틱 필름으로 덮었습니다.커버 레이어의 T-클립 디자인을 사용하여 3개의 레이어를 기판에 조립했습니다.T-클램프는 두 다리 사이에 틈이 있습니다.클립을 홈에 삽입하면 두 다리가 약간 구부러졌다가 원래 상태로 돌아가 홈을 통과하면서 뚜껑과 뒷면을 단단히 묶었습니다 (보조 그림 S1).그런 다음 커넥터를 사용하여 4개의 레이어를 조립합니다.
FAST의 다양한 기능적 구획과 특징을 보여주는 플랫폼의 개략도.b FAST-POCT 플랫폼의 확대 다이어그램.c 미국 4분의 1달러 동전 옆에 있는 플랫폼 사진.
FAST-POCT 플랫폼의 작동 메커니즘은 그림 2에 나와 있습니다. 주요 구성 요소는 베이스 레이어의 블록과 커버 레이어의 힌지로, 4개의 레이어를 T자형으로 조립할 때 간섭 디자인이 발생합니다. .공기압이 가해지지 않은 경우(그림 2a) 억지끼워맞춤으로 인해 힌지가 휘어지고 변형되며, 레버를 통해 실링력이 가해져 탄성필름이 블록에 눌리게 되어 실 공동 내의 액체가 정의됩니다. 봉인된 상태로.이 상태에서는 도 2a의 측면도에 도시된 바와 같이 레버가 바깥쪽으로 구부러진다는 점에 유의해야 한다.공기가 공급되면(그림 2b), 탄성막이 커버 쪽으로 바깥쪽으로 팽창하고 레버를 위로 밀어 올려 레버와 블록 사이에 틈을 열어 유체가 다음 챔버로 흐를 수 있도록 하며, 이를 열린 상태로 정의합니다. .공기압이 빠지면 힌지의 탄성으로 인해 레버가 원래 위치로 돌아가 팽팽한 상태를 유지할 수 있습니다.레버 움직임에 대한 비디오는 보충 영화 S1에 제공됩니다.
A. 닫았을 때의 개략도 및 사진.압력이 없으면 레버가 멤브레인을 블록에 밀어 넣고 액체가 밀봉됩니다.b 상태 양호합니다.압력이 가해지면 멤브레인이 팽창하고 레버를 위로 밀어 올려 채널이 열리고 유체가 흐를 수 있습니다.c 임계 압력의 특성 크기를 결정합니다.특징적인 치수에는 레버의 길이(L), 슬라이더와 힌지 사이의 거리(l), 레버 돌출부의 두께(t)가 포함됩니다.Fs는 스로틀 지점 B에서의 압축력입니다. q는 레버에 균일하게 분포된 하중입니다.Tx*는 힌지 레버에 의해 발생된 토크를 나타냅니다.임계 압력은 레버를 올리고 유체가 흐르게 하는 데 필요한 압력입니다.d 임계 압력과 요소 크기 사이의 관계에 대한 이론적 및 실험적 결과.n = 6개의 독립적인 실험이 수행되었으며 데이터는 ± 표준 편차로 표시됩니다.원시 데이터는 원시 데이터 파일로 표시됩니다.
간격이 열리는 임계 압력 Pc의 기하학적 매개변수에 대한 의존성을 분석하기 위해 빔 이론을 기반으로 한 분석 모델이 개발되었습니다(예: L은 레버의 길이, l은 블록과 블록 사이의 거리). 힌지, S는 레버입니다. 액체와의 접촉 면적 t는 그림 2c)와 같이 레버 돌출부의 두께입니다.보충 설명 및 보충 그림 S3에 자세히 설명된 대로 \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\)일 때 간격이 열립니다. 여기서 Fs는 토크입니다. \({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) 억지끼움과 관련된 힘을 제거하고 힌지가 구부러지는 원인이 됩니다.실험 반응과 분석 모델은 좋은 일치를 보여줍니다(그림 2d). 이는 t/l이 증가하고 L이 감소함에 따라 임계 압력 Pc가 증가한다는 것을 보여줍니다. 이는 고전적인 빔 모델로 쉽게 설명됩니다. 즉, 토크는 t/Lift에 따라 증가합니다. .따라서 우리의 이론적 분석은 FAST-POCT 플랫폼 설계에 중요한 기초를 제공하는 레버 길이 L과 t/l 비율을 조정하여 임계 압력을 효과적으로 제어할 수 있음을 명확하게 보여줍니다.
FAST-POCT 플랫폼은 성공적인 POCT의 가장 중요한 기능인 다기능 디스펜싱(삽입 및 실험이 포함된 그림 3a 참조)을 제공합니다. 이는 유체가 모든 방향 및 순서(계단식, 동시, 순차적) 또는 선택적 다중 채널로 흐를 수 있는 곳입니다. 분배 .– 투여 기능.그림에.그림 3a(i)는 다양한 반응물을 분리하기 위한 블록과 개방 및 폐쇄 상태를 제어하기 위한 레버를 사용하여 두 개 이상의 챔버가 계단식으로 연결된 계단식 투여 모드를 보여줍니다.압력이 가해지면 액체는 계단식으로 상부 챔버에서 하부 챔버로 흐릅니다.캐스케이드 챔버는 습식 화학물질이나 동결건조 분말과 같은 건식 화학물질로 채워질 수 있다는 점에 유의해야 합니다.그림 3a(i)의 실험에서는 위쪽 챔버의 빨간색 잉크가 파란색 염료 분말(황산구리)과 함께 두 번째 챔버로 흐르고 아래쪽 챔버에 도달하면 진한 파란색으로 변합니다.또한 펌핑되는 유체의 제어 압력도 표시됩니다.마찬가지로 하나의 레버를 두 개의 챔버에 연결하면 그림과 같이 동시 주입 모드가 된다.3a(ii)에서는 압력이 가해질 때 액체가 두 개 이상의 챔버에 균일하게 분포될 수 있습니다.임계압력은 레버의 길이에 따라 달라지므로 레버의 길이를 조정하면 그림과 같은 순차적 분사 패턴을 얻을 수 있습니다.3a(iii).챔버 B에는 긴 레버(임계 압력 Pc_long)가 연결되고 챔버 A에는 짧은 레버(임계 압력 Pc_short > Pc_long)가 연결되었습니다. 압력 P1(Pc_long < P1 < Pc_short)이 가해지면서 빨간색 액체만 빨간색으로 표시됩니다. 챔버 B로 흐를 수 있고 압력이 P2(> Pc_short)로 증가하면 파란색 액체가 챔버 A로 흐를 수 있습니다. 이 순차 주입 모드는 관련 챔버로 순차적으로 전달되는 다양한 액체에 적용되며 이는 성공적인 POCT에 매우 중요합니다. 장치.챔버 B에는 긴 레버(임계 압력 Pc_long)가 연결되고 챔버 A에는 짧은 레버(임계 압력 Pc_short > Pc_long)가 연결되었습니다. 압력 P1(Pc_long < P1 < Pc_short)이 가해지면서 빨간색 액체만 빨간색으로 표시됩니다. 챔버 B로 흐를 수 있고 압력이 P2(> Pc_short)로 증가하면 파란색 액체가 챔버 A로 흐를 수 있습니다. 이 순차 주입 모드는 관련 챔버로 순차적으로 전달되는 다양한 액체에 적용되며 이는 성공적인 POCT에 매우 중요합니다. 장치.Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был соединен с камерой B, а короткий рычаг (с критическим давлением Pc_short > Pc_long) соединен с камерой A. При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) только жидкость, выделенная красным может течь в 카메라 B, и когда давление было увеличено до P2 (> Pc_short), синяя жидкость может течь в камеру A. Этот режим последовательного прыска применяется к различным жидкостям, последовательно перемечемым в соответствушие камеры, что imiет решавение для успешной POCT.긴 레버(임계 압력 Pc_long)는 챔버 B에 연결되고 짧은 레버(임계 압력 Pc_short > Pc_long)는 챔버 A에 연결되었습니다. 압력 P1(Pc_long < P1 < Pc_short)이 적용되면 액체만 강조 표시됩니다. 빨간색의 액체는 챔버 B로 흐를 수 있으며 압력이 P2(> Pc_short)로 증가하면 파란색 액체가 챔버 A로 흐를 수 있습니다. 이 순차 주입 모드는 각 챔버로 순차적으로 전달되는 서로 다른 유체에 적용되며 이는 매우 중요합니다. 성공적인 POCT를 위해장치. Длинный рычаг(критическое давление Pc_long) соединен с камерой B, а короткий рычаг(критическое давление Pc_short > Pc_long) соединен с 메리 A.긴 암(임계 압력 Pc_long)은 챔버 B에 연결되고 짧은 암(임계 압력 Pc_short > Pc_long)은 챔버 A에 연결됩니다.При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в камеру B может поступать только красная жидкость, а при увеличении давления до P2( > Pc_short) в камеру A может поступать синяя жидкость.압력 P1(Pc_long < P1 < Pc_short)이 가해지면 빨간색 액체만 B 챔버로 들어갈 수 있고, 압력을 P2(> Pc_short)로 높이면 파란색 액체가 챔버 A로 들어갈 수 있습니다. 이 순차 주입 모드는 챔버 B의 순차적 이송에 적합합니다. POCT 장치의 성공적인 작동을 위해 매우 중요한 다양한 유체를 각 챔버에 넣습니다.그림 3a(iv)는 선택적 분사 모드를 보여줍니다. 여기서 메인 챔버에는 챔버 A와 챔버 B에 각각 연결된 짧은 레버(임계 압력 Pc_short)와 긴 레버(임계 압력 Pc_long < Pc_short)가 있습니다. 챔버 B에 연결된 다른 공기 채널로 액체를 먼저 챔버 A로 전달하기 위해 압력 P1(Pc_long < P1 < Pc_short)과 P1 + P2 > Pc_short를 갖는 P2(P2 > P1)가 장치에 동시에 적용되었습니다.그림 3a(iv)는 선택적 분사 모드를 보여줍니다. 여기서 메인 챔버에는 챔버 A와 챔버 B에 각각 연결된 짧은 레버(임계 압력 Pc_short)와 긴 레버(임계 압력 Pc_long < Pc_short)가 있습니다. 챔버 B에 연결된 다른 공기 채널로 액체를 먼저 챔버 A로 전달하기 위해 압력 P1(Pc_long < P1 < Pc_short)과 P1 + P2 > Pc_short를 갖는 P2(P2 > P1)가 장치에 동시에 적용되었습니다.그림에.3а(iv) показан режим селективного впрыска, при котором основная 카메라 имела короткий(с критическим давлением Pc_short) 및 длинны й рычаг(с критическим давлением Pc_long < Pc_short), которые дополнительно соединялись с камерой A 및 камерой B соответственно.그림 3a(iv)는 메인 챔버에 짧은 레버(임계 압력 Pc_short)와 긴 레버(임계 압력 Pc_long < Pc_short)가 있고 챔버 A와 챔버 B에 각각 추가로 연결된 선택적 주입 모드를 보여줍니다.к другому воздушному каналу, соединенному с камерой B. Чтобы сначала передать жидкость в камеру A, к устройству одновременн о прикладывали давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) и P2 (P2 > P1), где P1 + P2 > Pc_short.챔버 B에 연결된 다른 공기 채널로. 먼저 유체를 챔버 A로 전달하기 위해 압력 P1(Pc_long < P1 < Pc_short) 및 P2(P2 > P1)가 장치에 동시에 적용되었습니다. 여기서 P1 + P2 > Pc_short입니다. 3а(iv) показан режим селективного впрыска, когда основная камера imiет короткий стержень(с критическим давлением Pc_short) 및 дли нный стержень (с критическим давлением Pc_long < Pc_short), соединенные с камерой A и камерой B соответственно, и в дополнение к другому воздушному 카날루, B.도 3a(iv)는 메인 챔버에 챔버 A와 챔버 B가 각각 연결된 짧은 스템(임계압력 Pc_short)과 긴 스템(임계압 Pc_long < Pc_short)이 있고, 또 다른 공기 통로가 추가된 경우의 선택적 분사 모드를 나타낸 것이며, B룸과 연결되어 있어요.따라서 P2는 액체가 챔버 B로 들어가는 것을 방지합니다.그 사이에 총 압력 P1 + P2가 임계 압력을 초과하여 챔버 A에 연결된 짧은 레버를 활성화하여 액체가 챔버 A로 흐르도록 했습니다. 그런 다음 챔버 B를 채워야 하는 경우 P1만 적용하면 됩니다(Pc_long < 긴 레버를 활성화하고 액체가 챔버 B로 흐르도록 하는 메인 챔버의 P1 < Pc_short). 챔버 A의 액체가 챔버에서 증가하는 동안 챔버 A의 액체가 일정하게 유지되는 시간 t = 3초부터 9초까지 명확하게 관찰할 수 있습니다. B. 압력 P1이 가해졌을 때.그 사이에 총 압력 P1 + P2가 임계 압력을 초과하여 챔버 A에 연결된 짧은 레버를 활성화하여 액체가 챔버 A로 흐르도록 했습니다. 그런 다음 챔버 B를 채워야 하는 경우 P1만 적용하면 됩니다(Pc_long < 긴 레버를 활성화하고 액체가 챔버 B로 흐르도록 하는 메인 챔버의 P1 < Pc_short). 챔버 A의 액체가 챔버에서 증가하는 동안 챔버 A의 액체가 일정하게 유지되는 시간 t = 3초부터 9초까지 명확하게 관찰할 수 있습니다. B. 압력 P1이 가해졌을 때.Meжду tem, обчее давление P1 + P2 превысило критическое давление, чтобы активировать более короткий рычаг, соединенный с каме рой A, чтобы позволить жидкости течь в камеру A. Затем, когда требуется заполнить камеру B, нам нужно только применить P1 (Pc_long < P1 < PC_단축 ) в основной камере, чтобы aktивировать длинный рычаг 및 дать жидкости течь в камеру B. Moжно ясно наблудать, что в период с t = 3 с до 9 с жидкость в камере A оставалась постоянной, в то время как в камере она увеличивалась.한편, 총 압력 P1 + P2가 임계 압력을 초과하여 챔버 A에 연결된 더 짧은 레버를 활성화하여 액체가 챔버 A로 흐르도록 합니다. 그런 다음 챔버 B를 채워야 할 때 P1(Pc_long < P1)만 적용하면 됩니다. < Pc_short )를 메인 챔버에서 사용하여 긴 레버를 활성화하고 액체가 챔버 B로 흐르도록 합니다. t = 3초와 9초 사이에 챔버 A의 액체는 일정하게 유지되는 반면 챔버에서는 증가하는 것을 명확하게 관찰할 수 있습니다.B는 압력 P1이 적용될 때입니다.동시에 총 압력 P1 + P2가 임계 압력을 초과하여 A 챔버를 연결하는 더 짧은 레버를 작동시켜 유체가 A 챔버로 흐를 수 있게 합니다.챔버 A를 채울 때가 되면 간단히 메인 챔버에 P1을 적용하고 보조 챔버에 P2를 적용하면 됩니다.이러한 방식으로 카메라 A와 B 사이에서 흐름 동작을 선택적으로 전환할 수 있습니다. 4가지 다기능 배포 모드의 흐름 동작은 보충 영화 S2에서 확인할 수 있습니다.
다기능 할당, 즉 (i) 계단식, (ii) 동시, (iii) 순차 및 (iv) 선택적 할당의 그림입니다.곡선은 이러한 네 가지 배포 모드의 작업흐름과 매개변수를 나타냅니다.b 탈이온수와 에탄올의 장기 보관 테스트 결과.n = 5개의 독립적인 실험이 수행되었으며 데이터는 ±sd c로 표시됩니다.FAST 장치와 모세관 밸브(CV) 장치가 (i) 정적 상태 및 (ii) 진동 상태에 있을 때의 안정성 테스트 시연입니다.(iii) 다양한 각주파수에서 FAST 및 CV 장치의 볼륨 대 시간.d (i) FAST 장치 및 (ii) CV 장치에 대한 요청 시 테스트 결과 게시.(iii) 간헐적 압력 모드를 사용하는 FAST 및 CV 장치의 볼륨과 시간 간의 관계.모든 스케일 바, 1cm.원시 데이터는 원시 데이터 파일로 제공됩니다.
시약의 장기 보관은 훈련받지 않은 인력이 여러 시약을 처리할 수 있게 해주는 성공적인 POCT 장치의 또 다른 중요한 기능입니다.많은 기술이 장기 보관 가능성을 보여주었지만(예: 마이크로 디스펜서 35개, 블리스터 팩 48개, 스틱 팩 49개), 패키지를 수용하기 위해 전용 수납 공간이 필요하므로 비용과 복잡성이 증가합니다.더욱이 이러한 보관 메커니즘은 주문형 분배를 허용하지 않으며 포장에 남은 음식으로 인해 시약이 낭비되는 결과를 낳습니다.약간의 거칠기와 가스 투과에 대한 저항성으로 인해 CNC 가공 PMMA 재료를 사용하여 가속 수명 테스트를 수행하여 장기 보관 능력을 검증했습니다(보충 그림 S5).테스트 장치는 65°C에서 9일 동안 탈이온수(탈이온수)와 70% 에탄올(휘발성 시약 시뮬레이션)로 채워졌습니다.탈이온수와 에탄올 모두 위에서 접근을 차단하기 위해 알루미늄 호일을 사용하여 보관했습니다.문헌50,51에 보고된 Arrhenius 방정식과 침투 활성화 에너지를 사용하여 실시간 등가물을 계산했습니다.그림에.그림 3b는 65°C에서 9일 동안 보관된 5개 샘플의 평균 중량 손실 결과를 보여줍니다. 이는 23°C에서 2년 동안 탈이온수의 경우 0.30%, 70% 에탄올의 경우 0.72%에 해당합니다.
그림에.3c는 진동 테스트를 보여준다.모세관 밸브(CV)는 기존 POCT28,29 장치 중에서 가장 널리 사용되는 유체 처리 방법이므로 폭 300μm, 깊이 200μm의 CV 장치를 비교에 사용했습니다.두 장치가 모두 정지 상태로 유지되면 FAST-POCT 플랫폼의 유체가 밀봉되고 CV 장치의 유체가 채널의 갑작스러운 확장으로 인해 잠겨 모세관력이 감소하는 것을 볼 수 있습니다.그러나 궤도 진동기의 각주파수가 증가함에 따라 FAST-POCT 플랫폼의 유체는 밀봉된 상태로 유지되지만 CV 장치의 유체는 하부 챔버로 흐릅니다(보충 영화 S3 참조).이는 FAST-POCT 플랫폼의 변형 가능한 힌지가 모듈에 강한 기계적 힘을 가하여 챔버의 액체를 단단히 닫을 수 있음을 시사합니다.그러나 CV 장치에서는 고체, 공기 및 액체상 간의 균형으로 인해 액체가 유지되어 불안정성이 발생하고 진동으로 인해 균형이 깨져 예상치 못한 흐름 동작이 발생할 수 있습니다.FAST-POCT 플랫폼의 장점은 안정적인 기능을 제공하고 배송 및 작동 중에 일반적으로 발생하는 진동이 있는 경우 오류를 방지한다는 것입니다.
FAST-POCT 플랫폼의 또 다른 중요한 기능은 주문형 릴리스이며, 이는 정량 분석의 핵심 요구 사항입니다.그림에.3d는 FAST-POCT 플랫폼과 CV 장치의 주문형 릴리스를 비교합니다.그림에서.3d(iii)에서는 FAST 장치가 압력 신호에 빠르게 반응하는 것을 볼 수 있습니다.FAST-POCT 플랫폼에 압력이 가해지면 유체가 흐르고, 압력이 해제되면 흐름이 즉시 중단됩니다(그림 3d(i)).이 동작은 레버를 블록에 대해 뒤로 밀어 챔버를 닫는 힌지의 빠른 탄성 복귀로 설명될 수 있습니다.그러나 CV 장치에는 유체가 계속 흐르고 결국 압력이 해제된 후 약 100μl의 예상치 못한 유체량이 발생했습니다(그림 3d(ii) 및 보충 영화 S4).이는 첫 번째 주입 후 CV가 완전히 젖었을 때 모세관 고정 효과가 사라지는 것으로 설명할 수 있습니다.
동일한 장치에서 다양한 습윤성과 점도의 액체를 처리하는 능력은 POCT 응용 분야의 과제로 남아 있습니다.습윤성이 좋지 않으면 채널에서 누출이나 기타 예상치 못한 흐름 동작이 발생할 수 있으며 점성이 높은 액체를 준비하려면 소용돌이 혼합기, 원심 분리기 및 필터와 같은 보조 장비가 필요한 경우가 많습니다.52우리는 임계 압력과 유체 특성(광범위한 습윤성과 점도 포함) 사이의 관계를 테스트했습니다.결과는 표 1과 비디오 S5에 나와 있습니다.서로 다른 습윤성과 점도의 액체를 챔버에 밀봉할 수 있으며, 압력을 가하면 점도가 최대 5500cP인 액체도 인접한 챔버로 이송되어 높은 농도의 시료를 검출할 수 있음을 알 수 있습니다. 점도(즉, 호흡기 질환 진단에 사용되는 점성이 매우 높은 샘플인 가래).
위의 다기능 디스펜싱 장치를 결합하면 다양한 FAST 기반 POCT 장치를 개발할 수 있습니다.예가 그림 1에 나와 있습니다. 플랜트에는 사전 저장 챔버, 혼합 챔버, 반응 챔버 및 폐기물 챔버가 포함되어 있습니다.시약은 사전 보관 챔버에 장기간 보관된 후 혼합 챔버로 배출될 수 있습니다.적절한 압력을 사용하면 혼합된 반응물이 폐기물 챔버 또는 반응 챔버로 선택적으로 전달될 수 있습니다.
PCR 검출은 H1N1 및 코로나19와 같은 병원체를 검출하기 위한 최적의 표준이고 여러 반응 단계를 포함하기 때문에 우리는 PCR 검출을 위한 FAST-POCT 플랫폼을 애플리케이션으로 사용했습니다.그림에.도 4는 FAST-POCT 플랫폼을 이용한 PCR 테스트 과정을 보여준다.먼저, 용리시약, 자성 마이크로비드 시약, 세척액 A, 세척액 W를 각각 전보관실 E, M, W1, W2에 피펫팅하여 넣었다.RNA 흡착 단계는 그림 1에 나와 있습니다.(1) 압력 P1(=0.26bar)이 가해지면 샘플은 챔버 M으로 이동하여 혼합 챔버로 배출됩니다.(2) 혼합실 바닥에 연결된 포트 A를 통해 공기압 P2(=0.12bar)가 공급됩니다.많은 혼합 방법이 POCT 플랫폼에서 액체를 혼합하는 데 잠재력을 보였지만(예: 사문석 혼합 53, 무작위 혼합 54 및 배치 혼합 55) 혼합 효율성과 효과는 여전히 만족스럽지 않습니다.혼합 챔버 바닥에 공기를 도입하여 액체에 거품을 생성한 후 강력한 소용돌이가 몇 초 내에 완전한 혼합을 달성할 수 있는 버블 혼합 방식을 채택합니다.버블 혼합 실험이 수행되었으며 결과는 보충 그림 S6에 나와 있습니다.0.10bar의 압력을 가했을 때 완전한 혼합에 약 8초가 소요되는 것을 알 수 있다.압력을 0.20bar로 높이면 약 2초 안에 완전한 혼합이 이루어집니다.혼합 효율을 계산하는 방법은 방법 섹션에 나와 있습니다.(3) 루비듐 자석을 사용하여 비드를 추출한 다음 포트 P를 통해 P3(= 0.17bar)에 압력을 가하여 시약을 폐기물 챔버로 이동시킵니다.그림에.도 4b,c는 샘플에서 불순물을 제거하기 위한 세척 단계를 다음과 같이 보여줍니다. (1) 챔버 W1의 세척 용액 A는 압력 혼합 챔버 P1으로 배출됩니다.(2) 그런 다음 버블 혼합 과정을 수행합니다.(3) 세정액 A는 폐액실로 이송되고, 혼합실 내의 마이크로비드는 자석에 의해 끌어당겨진다.W 세척(그림 4c)은 세척 A(그림 4b)와 유사했습니다.각 세척 단계 A와 W는 두 번 수행되었다는 점에 유의해야 합니다.그림 4d는 비드에서 RNA를 용출하는 용출 단계를 보여줍니다.용출 및 혼합 도입 단계는 위에서 설명한 RNA 흡착 및 세척 단계와 동일합니다.용리 시약이 압력 P3 및 P4(=0.23bar) 하에서 PCR 반응 챔버로 전달됨에 따라 임계 압력에 도달하여 PCR 반응 챔버의 암을 밀봉합니다.마찬가지로 P4 압력도 폐기물 챔버로 가는 통로를 막는 데 도움이 됩니다.따라서 모든 용리 시약은 4개의 PCR 반응 챔버에 고르게 분포되어 다중 PCR 반응을 시작했습니다.위의 절차는 보충 영화 S6에 나와 있습니다.
RNA 흡착 단계에서는 시료가 주입구 M으로 유입되어 미리 보관된 비드 용액과 함께 혼합 챔버로 주입됩니다.과립을 혼합하고 제거한 후 시약은 폐기물 챔버로 분배됩니다.b 및 c 세척 단계에서는 미리 저장된 다양한 세척 시약을 혼합 챔버에 도입하고, 비드를 혼합 및 제거한 후 시약을 폐액 챔버로 옮깁니다.d 용출 단계: 용출 시약 투입, 혼합, 비드 추출 후 시약을 PCR 반응 챔버로 옮깁니다.곡선은 다양한 단계의 작업흐름과 관련 매개변수를 보여줍니다.압력은 개별 챔버를 통해 가해지는 압력입니다.부피는 혼합 챔버에 있는 액체의 부피입니다.모든 눈금 막대는 1cm입니다.원시 데이터는 원시 데이터 파일로 제공됩니다.
PCR 테스트 절차가 수행되었으며 보충 그림 S7은 20분의 역전사 시간과 60분의 열 순환 시간(95 및 60°C)을 포함하는 열 프로필을 나타내며, 하나의 열 주기는 90초입니다(보충 영화 S7)..FAST-POCT는 기존 RT-PCR(열 주기 180초)보다 열 주기 1회(90초)를 완료하는 데 더 적은 시간이 필요합니다.이는 마이크로 PCR 반응 챔버의 높은 표면적 대 부피 비율과 낮은 열 관성으로 설명할 수 있습니다.챔버 표면은 96.6mm2이고 챔버 부피는 25mm3이므로 표면 대 부피 비율은 약 3.86입니다.보충 그림 S10에서 볼 수 있듯이 우리 플랫폼의 PCR 테스트 영역에는 후면 패널에 홈이 있어 PCR 챔버 바닥의 두께가 200μm입니다.온도 조절기의 발열면에는 열전도성 탄성 패드가 부착되어 테스트 박스 뒷면과 밀착됩니다.이는 플랫폼의 열 관성을 감소시키고 가열/냉각 효율을 향상시킵니다.열 순환 중에 플랫폼에 내장된 파라핀이 녹아 PCR 반응 챔버로 유입되어 시약 증발 및 환경 오염을 방지하는 밀봉제 역할을 합니다(보충 영화 S8 참조).
위에 설명된 모든 PCR 검출 프로세스는 프로그래밍된 압력 제어 장치, 자기 추출 장치, 온도 제어 장치 및 형광 신호 캡처 및 처리 장치로 구성된 맞춤형 FAST-POCT 기기를 사용하여 완전히 자동화되었습니다.참고로, RNA 분리를 위해 FAST-POCT 플랫폼을 사용한 다음, 비교를 위해 FAST-POCT 시스템과 데스크톱 PCR 시스템을 사용하여 PCR 반응에 추출된 RNA 샘플을 사용했습니다.결과는 보충 그림 S8에 표시된 것과 거의 동일했습니다.작업자는 간단한 작업을 수행합니다. 즉, 샘플을 M 챔버에 넣고 플랫폼을 기기에 삽입합니다.정량검사 결과는 약 82분만에 확인 가능합니다.FAST-POCT 도구에 대한 자세한 정보는 보충 그림에서 확인할 수 있습니다.C9, C10 및 C11.
인플루엔자 A(IAV), B(IBV), C(ICV) 및 D(IDV) 바이러스로 인한 인플루엔자는 전 세계적으로 흔한 현상입니다.이들 중 IAV와 IBV는 가장 심각한 사례와 계절성 전염병을 담당하며 세계 인구의 5~15%를 감염시키고 300만~500만 명의 중증 사례를 일으키며 매년 290,000~650,000명의 사망자를 발생시킵니다.호흡기 질환56,57.IAV 및 IB의 조기 진단은 이환율 및 관련 경제적 부담을 줄이는 데 필수적입니다.이용 가능한 진단 기술 중에서 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)이 가장 민감하고 특이적이며 정확한 것으로 간주됩니다(>99%)58,59.이용 가능한 진단 기술 중에서 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)이 가장 민감하고 특이적이며 정확한 것으로 간주됩니다(>99%)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой(ОТ-ПЦР) считается наиболее чувствительной, специфичной и точной (> 99%)58,59.이용 가능한 진단 방법 중에서 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)이 가장 민감하고 특이적이며 정확한(> 99%) 것으로 간주됩니다58,59. Отоступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой(ОТ-ПЦР) считается наиболее чув ствительной, специфичной и точной (>99%)58,59.이용 가능한 진단 방법 중에서 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)이 가장 민감하고 특이적이며 정확한(>99%) 것으로 간주됩니다58,59.그러나 기존 RT-PCR 방법은 반복적인 피펫팅, 혼합, 분배 및 유체 전달을 요구하므로 자원이 제한된 환경에서는 전문가의 사용이 제한됩니다.여기서 FAST-POCT 플랫폼은 각각 IAV 및 IBV의 PCR 검출에 사용되어 검출 하한(LOD)을 얻었습니다.또한 IAV와 IBV는 종 전체에 걸쳐 서로 다른 병원형을 구별하기 위해 다중화되어 유전자 분석을 위한 유망한 플랫폼과 질병을 정확하게 치료할 수 있는 능력을 제공합니다.
그림에.도 5a는 정제된 바이러스 RNA 150μl를 시료로 하여 HAV PCR을 테스트한 결과이다.그림에.도 5a(i)는 HAV 농도가 106 복사본/ml일 때 형광 강도(ΔRn)가 0.830에 도달할 수 있고, 농도가 102 복사본/ml로 감소하면 ΔRn이 여전히 0.365에 도달할 수 있다는 것을 보여줍니다. 빈 음성대조군(0.002)의 경우 약 100배 더 높습니다.6개의 독립적인 실험을 기반으로 한 정량화를 위해 IAV(그림 5a(ii))의 로그 농도와 주기 임계값(Ct) 사이에 선형 보정 곡선이 생성되었으며, R2 = 0.993, 범위는 102-106개 복사본/mL입니다.결과는 기존의 RT-PCR 방법과 잘 일치합니다.그림에.도 5a(iii)는 FAST-POCT 플랫폼의 40사이클 테스트 결과의 형광 이미지를 보여준다.우리는 FAST-POCT 플랫폼이 102개/mL만큼 낮은 HAV를 검출할 수 있다는 것을 발견했습니다.그러나 기존 방법에는 102 Copy/mL의 Ct 값이 없으므로 LOD는 약 103 Copy/mL입니다.우리는 이것이 기포 혼합의 높은 효율성 때문일 수 있다는 가설을 세웠습니다.정제된 IAV RNA에 대해 PCR 테스트 실험을 수행하여 진탕 혼합(기존 RT-PCR 작업과 동일한 혼합 방법), 바이알 혼합(이 방법, 0.12bar에서 3초) 및 대조군으로 혼합하지 않음을 포함한 다양한 혼합 방법을 평가했습니다. ..결과는 보충 그림 S12에서 확인할 수 있습니다.더 높은 RNA 농도(106개/mL)에서 다양한 혼합 방법의 Ct 값이 버블 혼합의 경우와 거의 동일하다는 것을 알 수 있습니다.RNA 농도가 102개/mL로 떨어졌을 때, 쉐이크 믹스와 대조군에는 Ct 값이 없는 반면, 버블 믹스 방법은 여전히 Ct 값 36.9를 제공했는데, 이는 Ct 임계값 38보다 낮았습니다. 결과는 지배적인 혼합 특성을 보여줍니다. 다른 문헌에서도 입증된 소포는 FAST-POCT 플랫폼의 민감도가 기존 RT-PCR보다 약간 높은 이유를 설명할 수도 있습니다.그림에.도 5b는 101 내지 106 copy/ml 범위의 정제된 IBV RNA 샘플의 PCR 분석 결과를 보여준다.결과는 IAV 테스트와 유사하여 R2 = 0.994 및 LOD 102개/mL를 달성했습니다.
TE 완충액을 음성 대조군(NC)으로 사용하여 IAV 농도가 106~101개/mL인 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 PCR 분석.(i) 실시간 형광 곡선.(ii) FAST 및 기존 테스트 방법에 대한 로그 IAV RNA 농도와 주기 임계값(Ct) 사이의 선형 보정 곡선.(iii) 40주기 후 IAV FAST-POCT 형광 이미지.b, (i) 실시간 형광 스펙트럼을 이용한 B형 인플루엔자 바이러스(IBV)의 PCR 검출.(ii) 선형 교정 곡선 및 (iii) 40주기 후 FAST-POCT IBV 형광 이미지.FAST-POCT 플랫폼을 사용한 IAV 및 IBV의 검출 하한(LOD)은 102개/mL로 기존 방법(103개/mL)보다 낮았습니다.c IAV 및 IBV에 대한 다중 테스트 결과.가능한 오염 및 배경 증폭을 방지하기 위해 GAPDH를 양성 대조군으로 사용하고 TE 완충액을 음성 대조군으로 사용했습니다.4가지 서로 다른 샘플 유형을 구별할 수 있습니다: (1) GAPDH 전용 음성 샘플("IAV-/IBV-");(2) IAV 및 GAPDH에 의한 IAV 감염("IAV+/IBV-");(3) IBV 및 GAPDH에 의한 IBV 감염("IAV-/IBV+");(4) IAV, IBV 및 GAPDH에 의한 IAV/IBV 감염("IAV+/IBV+").점선은 임계값 선을 나타냅니다.n = 6개의 생물학적으로 독립적인 실험이 수행되었으며, 데이터는 ± 표준 편차로 표시됩니다.원시 데이터는 원시 데이터 파일로 표시됩니다.
그림에.도 5c는 IAV/IBV에 대한 다중화 테스트 결과를 보여준다.여기서는 정제된 RNA 대신 바이러스 용해물을 샘플 용액으로 사용했으며, FAST-POCT 플랫폼의 4개의 서로 다른 반응 챔버에 IAV, IBV, GAPDH(양성 대조군) 및 TE 버퍼(음성 대조군)에 대한 4개의 프라이머를 추가했습니다.여기서는 가능한 오염 및 배경 강화를 방지하기 위해 양성 및 음성 컨트롤이 사용됩니다.테스트는 4개의 그룹으로 나누어졌습니다: (1) GAPDH 음성 샘플("IAV-/IBV-");(2) IAV 감염("IAV+/IBV-") 대 IAV 및 GAPDH;(3) IBV-.감염됨("IAV-") -/IBV+") IBV 및 GAPDH;(4) IAV, IBV 및 GAPDH에 의한 IAV/IBV("IAV+/IBV+") 감염.그림에.도 5c는 음성 샘플을 적용한 경우 양성 대조군 챔버의 형광 강도 ΔRn이 0.860이고, IAV 및 IBV의 ΔRn이 음성 대조군(0.002)과 유사함을 보여준다.IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ 및 IAV+/IBV+ 그룹의 경우 IAV/GAPDH, IBV/GAPDH 및 IAV/IBV/GAPDH 카메라는 각각 상당한 형광 강도를 보인 반면 다른 카메라는 배경에서도 형광 강도를 나타냈습니다. 열 순환 후 40 수준.위의 테스트에서 FAST-POCT 플랫폼은 뛰어난 특이성을 보여주었고 다양한 인플루엔자 바이러스의 병원형을 동시에 분류할 수 있게 해주었습니다.
FAST-POCT의 임상적 적용성을 검증하기 위해 우리는 IB 환자(n=18)와 비IB 대조군(n=18)의 36개 임상 검체(코 면봉 검체)를 테스트했습니다(그림 6a).환자 정보는 보충 표 3에 나와 있습니다. IB 감염 상태는 독립적으로 확인되었으며 연구 프로토콜은 Zhejiang University First Affiliated Hospital (Hangzhou, Zhejiang)에서 승인되었습니다.각 환자 샘플은 두 가지 범주로 나누어졌습니다.하나는 FAST-POCT를 사용하여 처리되었고 다른 하나는 데스크톱 PCR 시스템(SLAN-96P, 중국)을 사용하여 처리되었습니다.두 분석법 모두 동일한 정제 및 검출 키트를 사용합니다.그림에.도 6b는 FAST-POCT와 기존 역전사 PCR(RT-PCR)의 결과를 보여준다.형광 강도(FAST-POCT)를 -log2(Ct)와 비교했습니다. 여기서 Ct는 기존 RT-PCR의 주기 임계값입니다.두 가지 방법 사이에는 좋은 일치가 있었습니다.FAST-POCT와 RT-PCR은 Pearson's ratio(r) 값 0.90과 강한 양의 상관관계를 보여주었습니다(그림 6b).그런 다음 FAST-POCT의 진단 정확도를 평가했습니다.양성 및 음성 샘플에 대한 형광 강도(FL) 분포는 독립적인 분석 측정값으로 제공되었습니다(그림 6c).FL 값은 대조군보다 IB 환자에서 유의하게 더 높았습니다(****P = 3.31 × 10-19; 양측 t-검정)(그림 6d).다음으로 IBV 수신기 작동 특성(ROC) 곡선을 그렸습니다.우리는 진단 정확도가 1의 곡선 아래 영역으로 매우 우수하다는 것을 발견했습니다(그림 6e).2020년 현재 코로나19로 인해 중국에서 마스크 주문이 의무화되어 IBD 환자가 확인되지 않았기 때문에 모든 양성 임상 검체(예: 비강 면봉 검체)는 IBV 전용이었습니다.
임상 연구 설계.18명의 환자 샘플과 18개의 비인플루엔자 대조군을 포함하여 총 36개의 샘플을 FAST-POCT 플랫폼과 기존 RT-PCR을 사용하여 분석했습니다.b FAST-POCT PCR과 기존 RT-PCR 간의 분석적 일관성을 평가합니다.결과는 양의 상관관계를 보였습니다(Pearson r = 0.90).c 18명의 IB 환자와 18명의 대조군의 형광 강도 수준.d IB 환자(+)에서는 FL 값이 대조군(-)보다 유의하게 높았습니다(****P = 3.31 × 10-19; 양측 t-검정; n = 36).각 정사각형 도표에 대해 중앙의 검은색 마커는 중앙값을 나타내고 상자의 맨 아래 선과 맨 위 선은 각각 25번째 백분위수와 75번째 백분위수를 나타냅니다.수염은 이상값으로 간주되지 않는 최소 및 최대 데이터 포인트까지 확장됩니다.e ROC 곡선.점선 d는 ROC 분석을 통해 추정된 임계값을 나타냅니다.IBV의 AUC는 1입니다. 원시 데이터는 원시 데이터 파일로 제공됩니다.
본 글에서는 이상적인 POCT에 필요한 특성을 갖춘 FAST를 소개합니다.당사 기술의 장점은 다음과 같습니다. (1) 다양한 투여(다단계, 동시, 순차 및 선택), 요청 시 방출(인가된 압력의 신속하고 비례적인 방출) 및 안정적인 작동(150도 진동) (2) 장기 보관 (2년간의 가속 테스트, 체중 감소 약 0.3%);(3) 광범위한 습윤성 및 점도(최대 5500cP의 점도)를 갖는 액체로 작업할 수 있는 능력;(4) 경제성(FAST-POCT PCR 장치의 예상 재료비는 약 US$1입니다.)다기능 디스펜서를 결합하여 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 PCR 검출을 위한 통합 FAST-POCT 플랫폼을 시연하고 적용했습니다.FAST-POCT에는 82분 밖에 걸리지 않습니다.36개의 비강 면봉 샘플을 사용한 임상 테스트에서는 표준 RT-PCR(Pearson 계수 > 0.9)과 형광 강도가 좋은 일치를 보였습니다.36개의 비강 면봉 샘플을 사용한 임상 테스트에서는 표준 RT-PCR(Pearson 계수 > 0.9)과 형광 강도가 좋은 일치를 보였습니다.36개의 문서가 От-П에 대해 자세히 설명되어 있습니다. ЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).36개 비강 면봉 샘플을 사용한 임상 테스트에서는 표준 RT-PCR의 형광 강도(피어슨 계수 > 0.9)와 잘 일치하는 것으로 나타났습니다.RT-PCR 클리닉 36 образцов мазков из носа показали хорошее совпадение интенсивности флуоресценции со стандартной О -ПЦР(коэффициент Пирсона > 0,9).36개의 비강 면봉 표본에 대한 임상 테스트에서는 표준 RT-PCR과 형광 강도가 잘 일치하는 것으로 나타났습니다(피어슨 계수 > 0.9).이 작업과 병행하여 다양한 신흥 생화학적 방법(예: 플라즈마 열 사이클링, 증폭 없는 면역분석 및 나노바디 기능화 분석)이 POCT에서 잠재력을 보여주었습니다.그러나 완전히 통합되고 강력한 POCT 플랫폼이 없기 때문에 이러한 방법에는 필연적으로 별도의 전처리 절차(예: RNA 분리44, 인큐베이션45 및 세척46)가 필요하며, 이는 고급 POCT 기능을 구현하기 위해 이러한 방법으로 현재 작업을 더욱 보완합니다. 필수 매개변수.응답 출력 성능을 가져옵니다.이 작업에서 FAST 밸브를 활성화하는 데 사용되는 공기 펌프는 벤치탑 기기에 통합될 수 있을 만큼 작지만(그림 S9, S10) 여전히 상당한 전력을 소비하고 소음을 발생시킵니다.원칙적으로 더 작은 크기의 공압 펌프는 전자기력이나 손가락 작동과 같은 다른 수단으로 대체될 수 있습니다.추가 개선에는 예를 들어 가열/냉각 시스템이 필요하지 않은 새로운 검출 방법을 사용하여 다양하고 특정 생화학적 분석에 맞게 키트를 조정하여 PCR 응용을 위한 도구가 필요 없는 POCT 플랫폼을 제공하는 것이 포함될 수 있습니다.우리는 FAST 플랫폼이 액체를 조작하는 방법을 제공한다는 점을 고려할 때 제안된 FAST 기술이 생물 의학 테스트뿐만 아니라 환경 모니터링, 식품 품질 테스트, 재료 및 약물 합성을 위한 공통 플랫폼을 만들 수 있는 잠재력을 제시한다고 믿습니다. ..
인간 비강 면봉 표본의 수집 및 사용은 절강대학교 제1부속병원 윤리위원회(IIT20220330B)의 승인을 받았습니다.30세 미만 성인 16명, 40세 이상 성인 7명, 남성 19명, 여성 17명 등 36개의 비강 면봉 샘플을 수집했습니다.30세 미만 성인 16명, 40세 이상 성인 7명, 남성 19명, 여성 17명 등 36개의 비강 면봉 샘플을 수집했습니다.36 образцов мазков из носа, в которых приняли участие 16 взрослых < 30, 7 взрослых старше 40 лет, 19 мучи 17 세에.36개의 비강 면봉 표본은 30세 미만 성인 16명, 40세 이상 성인 7명, 남성 19명, 여성 17명으로부터 수집되었습니다..인구 통계 데이터는 보충 표 3에 나와 있습니다. 모든 참가자로부터 사전 동의를 얻었습니다.모든 참가자는 인플루엔자 감염이 의심되어 보상 없이 자발적으로 검사를 받았습니다.
FAST 베이스와 뚜껑은 폴리유산(PLA)으로 만들어졌으며 Ender 3 Pro 3D 프린터(Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.)로 인쇄되었습니다.양면 테이프는 Adhesives Research, Inc. 모델 90880에서 구입했습니다. 두께 100μm의 PET 필름은 McMaster-Carr에서 구입했습니다.접착제와 PET 필름은 모두 Silhouette America, Inc.의 Silhouette Cameo 2 절단기를 사용하여 절단되었습니다. 탄성 필름은 사출 성형을 통해 PDMS 재료로 만들어졌습니다.먼저 레이저 시스템을 사용하여 200μm 두께의 PET 프레임을 절단하고 100μm 양면 접착 테이프를 사용하여 3mm 두께의 PMMA 시트에 접착했습니다.그런 다음 PDMS 전구체(Sylgard 184; 파트 A: 파트 B = 10:1, Dow Corning)를 몰드에 붓고 유리 막대를 사용하여 과잉 PDMS를 제거했습니다.70℃에서 3시간 동안 경화시킨 후, 300μm 두께의 PDMS 필름을 몰드에서 벗겨낼 수 있었다.
다양한 배포, 주문형 출판 및 안정적인 성능을 위한 사진은 고속 카메라(Sony AX700 1000fps)로 촬영됩니다.신뢰성 테스트에 사용된 오비탈 셰이커는 SCILOGEX(SCI-O180)에서 구입한 것이다.공기 압력은 공기 압축기에 의해 생성되며 여러 개의 디지털 정밀 압력 조절기를 사용하여 압력 값을 조정합니다.흐름 동작 테스트 프로세스는 다음과 같습니다.미리 정해진 양의 유체를 테스트 장치에 주입하고 고속 카메라를 사용하여 흐름 동작을 기록했습니다.그런 다음 고정된 시간에 흐름 동작을 비디오에서 스틸 이미지를 촬영하고 Image-Pro Plus 소프트웨어를 사용하여 남은 영역을 계산한 다음 카메라 깊이를 곱하여 볼륨을 계산했습니다.흐름 동작 테스트 시스템에 대한 자세한 내용은 보충 그림 S4에서 확인할 수 있습니다.
바이알 혼합 장치에 마이크로비드 50μl와 탈이온수 100μl를 주입합니다.혼합 성능 사진은 0.1bar, 0.15bar, 0.2bar의 압력에서 0.1초마다 고속 카메라로 촬영되었습니다.혼합 과정 중 픽셀 정보는 사진 처리 소프트웨어(Photoshop CS6)를 사용하여 이러한 이미지에서 얻을 수 있습니다.그리고 혼합 효율은 다음 수학식 53을 통해 얻을 수 있다.
여기서 M은 혼합 효율, N은 총 샘플 픽셀 수, ci 및 \(\bar{c}\)는 정규화 및 예상 정규화 농도입니다.혼합 효율 범위는 0(0%, 비혼합)부터 1(100%, 완전 혼합)까지입니다.결과는 보충 그림 S6에 나와 있습니다.
IAV 및 IBV RNA 샘플(카탈로그 번호 RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, 중국), Tris-EDTA 완충액(TE 완충액 번호 B541019)을 포함한 IAV 및 IBV용 실시간 RT-PCR 키트 , Sangon Biotech, 중국), 양성 대조 RNA 정제 키트(부품 번호 Z-ME-0010, Liferiver, 중국) 및 GAPDH 솔루션(부품 번호 M591101, Sangon Biotech, 중국)은 시판 중입니다.RNA 정제 키트에는 결합 완충액, 세척 A, 세척 W, 용리액, 자성 마이크로비드 및 아크릴 캐리어가 포함되어 있습니다.IAV 및 IBV 실시간 RT-PCR 키트에는 IFVA 핵산 PCR 검출 믹스와 RT-PCR 효소가 포함되어 있습니다.500 µl의 결합완충용액에 6 µl의 AcrylCarrier와 20 µl의 자기비드를 첨가하고 잘 흔들어 준 후 비드용액을 준비합니다.세척액 A와 W에 에탄올 21ml를 첨가하고 잘 흔들어 세척액 A와 W의 용액을 각각 얻습니다.그런 다음 IFVA 핵산과 1 μl의 RT-PCR 효소를 포함하는 형광 PCR 혼합물 18 μl를 1 μl의 TE 용액에 첨가하고 몇 초간 흔들어 원심분리하여 20 μl의 IAV 및 IBV 프라이머를 얻었습니다.
다음 RNA 정제 절차를 따르십시오. (1) RNA 흡착.펠릿 용액 526μl를 1.5ml 원심분리 튜브에 피펫팅하고 시료 150μl를 첨가한 다음 수동으로 튜브를 위아래로 10회 흔듭니다.혼합물 676 μl를 친화성 컬럼으로 옮기고 60초 동안 1.88 x 104 g의 원심분리기를 사용합니다.이후의 배수구는 폐기됩니다.(2) 세탁의 첫 번째 단계.선호도 컬럼에 세척 용액 A 500 μl를 추가하고 1.88 x 104 g에서 40초 동안 원심분리한 다음 사용한 용액을 폐기합니다.이 세척 과정을 두 번 반복했습니다.(3) 세탁의 두 번째 단계.500 μl의 세척 용액 W를 친화성 컬럼에 추가하고 1.88×104 g에서 15초 동안 원심분리한 후 사용한 용액을 폐기합니다.이 세척 과정을 두 번 반복했습니다.(4) 용출.2분 동안 1.88 x 104 g에서 친화성 컬럼과 원심분리기에 용출액 200 μl를 추가합니다.(5) RT-PCR: 용출액을 PCR 튜브에 담긴 프라이머 용액 20μl에 주입한 후, 실시간 PCR 시험 장치(SLAN-96P)에 튜브를 넣어 RT-PCR을 진행하였다.전체 검출 과정은 약 140분(RNA 정제 20분, PCR 검출 120분)이 소요됩니다.
비드 용액 526μl, 세척액 A 1000μl, 세척액 W 1000μl, 용출액 200μl 및 프라이머 용액 20μl를 미리 첨가하여 챔버 M, W1, W2, E 및 PCR 검출 챔버에 보관했습니다.플랫폼 조립.그런 다음 150 μl의 샘플을 챔버 M에 피펫으로 넣고 FAST-POCT 플랫폼을 보충 그림 S9에 표시된 테스트 장비에 삽입했습니다.약 82분 후에 테스트 결과가 나왔습니다.
달리 명시하지 않는 한, 모든 테스트 결과는 FAST-POCT 플랫폼과 생물학적으로 독립적인 샘플만 사용하여 최소 6회 반복 후 평균 ± SD로 표시됩니다.분석에서 제외된 데이터는 없습니다.실험은 무작위가 아닙니다.연구자들은 실험 중에 그룹 작업에 대해 눈이 멀지 않았습니다.
연구 설계에 대한 자세한 내용은 이 기사에 링크된 Nature Research Report 요약을 참조하세요.
이 연구 결과를 뒷받침하는 데이터는 보충 정보에서 확인할 수 있습니다.이 글은 원본 데이터를 제공합니다.
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